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今天推荐的是由美国诺华制药生物医学研究所在年9月13日发表于NatureCommunications（IF：12.，JCR1区）的一篇文章，通讯作者是FengCong教授，研究表明USP7通过促进Axin的稳定性来抑制Wnt/β-catenin信号传导。研究背景
Axin是负责形成β-catenin破坏复合物的关键支架蛋白。Axin蛋白的稳定性受到泛素-蛋白酶体系统的调节，而Axin蛋白细胞浓度的调节对Wnt/β-catenin信号传导具有深远的影响。尽管已鉴定出促进Axin泛素化的E3，但负责Axin泛素化和稳定的去泛素酶仍是未知的。摘要部分
作者通过CRISPR筛选将USP7鉴定为Wnt/β-catenin信号转导的负调控蛋白。USP7的遗传消融或药理抑制作用可在多个细胞系统中稳步提高Wnt/β-catenin信号传导。USP7通过其TRAF结构域直接与Axin相互作用，并促进Axin的去泛素化和稳定化。另一方面，USP7的抑制通过增加Wnt/β-catenin信号传导来调节成骨细胞和脂肪细胞的分化。作者的研究揭示了一种关键机制，该机制可防止Axin过度降解，并将USP7识别为使细胞对Wnt/β-catenin信号敏感的靶标。研究内容
1.USP7是Wnt/β-catenin信号转导的有效负调节器为了发现Wnt/β-catenin信号的未知调控因子，作者在稳定表达Cas9和具有多个TCF结合位点的转录报告子SuperTopFlash-GFP（STF-GFP）的HEKT细胞中进行了全基因组CRISPR筛选。在该报告系统中USP7被认定为Wnt信号转导的负调节器。为了验证筛选结果，作者通过慢病毒转导将独立的USP7gRNA引入HEKT细胞，并用Wnt3aCM处理USP7敲除细胞库并进行FACS分析。结果发现，USP7敲除显着增强了HEKT细胞中Wnt3a诱导的STF-GFP。同时，USP7的敲除增强了Wnt3a诱导的HEKT细胞中活性β-catenin的积累。接下来，作者试图确定USP7的过表达是否影响Wnt/β-catenin信号传导。相比对照组，USP7（WT）的异位表达强烈抑制Wnt3a诱导的STF报告基因和β-连环蛋白的积累。USP7CA突变体的异位表达则略微增加了Wnt3a诱导的STF报告基因。此外，作者通过将野生型USP7和CA突变体重新引入USP7基因敲除的HEKTSTF-GFP细胞中进行了回补实验。USP7敲除细胞表达高水平的STF-GFP，其被野生型USP7强烈抑制，但未被CA突变体抑制。
图1.USP7是Wnt/β-catenin信号转导的有效负调节器
研究结论：USP7负调控Wnt/β-catenin信号传导，并且该功能取决于其去泛素酶活性。2.USP7抑制剂增强Wnt/β-catenin信号传导接下来作者作者使用STF-Luc测定法和CellTiter-Glo（CTG）测定法以剂量反应方式测量了各种USP7抑制剂对Wnt/β-catenin信号传导和细胞增殖的影响。所有新一代USP7抑制剂，包括Almac，Almac，P5041，FT和GNE-，均增加了STF报告基因。Almac4和Almac47具有最强的Wnt刺激活性。在所有测试浓度下，两种化合物均不影响HEKTUSP7KO细胞的增殖，这表明Almac4和Almac47的脱靶活性最低。这些数据共同表明，USP7的药理学抑制作用增强了不同细胞系中的Wnt/β-catenin信号传导。
图2.USP7抑制剂可增强Wnt/β-catenin信号传导
研究结论：USP7抑制剂可增强Wnt/β-catenin信号传导。3.USP7促进Axin的去泛素化和稳定化Axin是β-catenin破坏复合物的关键支架蛋白，Axin浓度的调节对Wnt/β-catenin信号传导具有深远的影响。作者研究发现，在没有外源性Wnt的情况下，敲除USP7会降低AXIN1的表达，但不会降低β-catenin破坏复合物的其他成分。接下来，作者检测了USP7基因敲除对Wnt诱导的Axin降解的影响。Wnt3a增加了AXIN1的降解，并且通过USP7敲除进一步增强了这种作用。同时，野生型USP7的过表达增加了HEKT细胞中共表达的Axin1蛋白的蛋白水平。这些数据强烈表明，USP7通过抑制其蛋白酶体降解来稳定Axin蛋白。由于USP7通过促进其去泛素作用来稳定其底物，因此作者研究了USP7是否会影响Axin的泛素化。研究发现，野生型USP7的过表达降低了异位表达的Axin1的多聚泛素化作用。接下来，作者通过体外去泛素化试验证实了Axin是USP7的直接底物。不仅如此，研究结果表明USP7的过表达抑制了RNF或SIAH1诱导的Axin的多聚泛素化。
图3USP7促进Axin的去泛素化和稳定化
研究结论：这些结果表明，USP7通过抵消RNF和SIAH1诱导的泛素化和Axin的降解来抑制Wnt信号传导。4.USP7中的TRAF结构域与Axin结合USP7在Axin1串联亲和力蛋白质纯化质谱筛查系统中获得了成功。接下来，作者检查了USP7的哪个域负责Axin相互作用。USP7包含三个主要结构域，包括一个氨基末端肿瘤坏死相关因子样（TRAF）结构域，一个中间催化结构域和一个羧基末端串联UBL结构域（TUD），其中包含五个泛素样折叠。如图4d所示，Axin1与USP7的TRAF结构域（而非TUD结构域）共免疫沉淀。实验结果表明，USP7的TRAF域与AXIN1和AXIN2相互作用的方式类似于与其他USP7底物的结合方式。
图4USP7通过其TRAF结构域直接与Axin结合
研究结论：USP7通过其TRAF域直接与Axin1的多个位点相互作用。5.USP7抑制Wnt诱导的成骨细胞分化由于USP7负调控Wnt信号，作者研究了USP7在小鼠多能间充质干细胞C3H10T1/2和小鼠骨髓基质细胞ST2中成骨细胞分化中的功能。Almac4的处理增强了C3H10T1/2和ST2细胞中Wn3a诱导的碱性磷酸酶染色。同样的，Almac4增加了C3H10T1/2和ST2细胞中Wnt3a诱导的碱性磷酸酶（Alpl）和β-catenin靶基因Axin2和Lef1的mRNA水平。接下来，作者进一步实验发现，ODM增加了C3H10T1/2细胞中活性β-catenin的水平，而USP7抑制剂Almac4进一步增强了该活性。在存在ODM的情况下，C3H10T1/2和ST2细胞中USP7的基因敲除或药理抑制作用增加了碱性磷酸酶染色和Alpl和β-catenin靶基因的mRNA表达。
图5.USP7抑制Wnt诱导的成骨细胞分化
研究结论：USP7通过减弱Wnt/β-catenin信号传导抑制成骨细胞分化。6.USP7通过抑制Wnt信号传导来促进脂肪细胞分化众所周知，Wnt/β-catenin信号传导抑制脂肪细胞分化。作者研究了USP7在使用小鼠前脂肪细胞细胞系3T3-L的脂肪细胞分化中的作用。与C3H10T1/2和ST2不同，3P3-L1的增殖不受USP7抑制。使用独立的gRNA敲除Usp7增强了Wnt3a诱导的活性β-连环蛋白的积累。USP7抑制剂Almac4的治疗也增加了活性β-catenin的积累。这些结果表明，USP7抑制3T3-L1细胞中的Wnt/β-catenin信号传导。接下来，作者研究了USP7在用脂肪细胞分化培养基处理过的3T3-L1细胞中β-catenin信号传导中的作用。与先前的发现一致，脂肪细胞分化培养基降低了3T3-L1细胞中胞质β-catenin的水平。这些结果表明，USP7敲除增加了用脂肪细胞分化培养基处理的细胞中的Wnt/β-catenin信号传导。与Wnt/β-catenin信号传导阻滞脂肪细胞分化的观点一致，USP7敲除强烈抑制脂肪细胞分化介质诱导的脂滴形成和成脂标记物的表达。
图6.USP7通过抑制Wnt信号传导促进脂肪细胞分化
研究结论：USP7抑制主要通过激活Wnt信号传导来阻止脂肪细胞分化。
结论与讨论
Thankyou!往期链接1.乳腺癌中USP1通过泛素化修饰调控TAZ蛋白的稳定性2.想发高分文章？或许可以试下这个研究思路，赶紧学习下3.USP1靶向ULK1并调节其细胞区室化和自噬4.去泛素酶USP1的抑制使KPNA2不稳定并抑制乳腺癌转移5.β-catenin的异常激活可通过USP1稳定EZH2驱动神经胶质瘤的发生6.综合分析USP1在肝癌中的重要作用7.FANCI和FANCD2不同的泛素化功能使ID2-DNA稳定结合8.Rheb泛素化调控生长因子诱导的mTORC1激活9.FA蛋白FANCI在核糖体的生物合成中发挥作用10.ATR介导的FANCI磷酸化同时调控FANCD2的泛素化和去泛素化11.USP1通过去泛素化Akt抑制长期饥饿时肌肉中的PI3K-Akt-Foxo信号转导12.USP2通过拮抗E3-泛素连接酶IDOL调控LDLR信号通路预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇
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