来源：赛业生物科技
CRISPR基因编程技术原理的基础
CRISPR基因编程技术的发现来自细菌抵抗病毒入侵的免疫机制。CRISPR（Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats）是对细菌基因组中某种特殊重复序列结构的简称，即成簇规律间隔的短回文重复序列。当同样的病毒再次感染细菌时，这些由于病毒感染细菌后在细菌基因组中形成的特殊重复序列，可以根据入侵病毒DNA序列的特点，形成特异且互补靶序列的引导RNA（guideRNA）,并与细菌自身的Cas9核酸酶（常用能切割双链DNA的蛋白）形成复合物，使原本非特异性的Cas9核酸酶活性转化为能特异性切割双链DNA的作用，达到特异性抗病毒的免疫防御目的。
在模式动物研究中的应用
CRISPR基因编辑技术是通过设计与构建针对靶基因DNA序列（～22bp）互补的引导RNA，并与Cas9核酸酶一起直接导入实验动物的生殖细胞，因特异性引导RNA的定位，Cas9核酸酶对靶DNA进行特异性切割，造成双链靶DNA的断裂，诱发内源性DNA的非同源末端修复机制（non-homologousendjoining，NHEJ）,而修复过程则会引起DNA核苷酸的缺失或增加等错配，导致基因移码突变，实现基因敲除（Knockout,KO）模式动物建立的目的。如果需要对目的基因进行特定修饰（点突变，基因插入等），则要在CRISPR基因敲除构建策略的基础上，添加计划插入修饰的DNA片段（donorDNA），达到对特定基因插入和替换遗传修饰。
继ZFN和TALEN基因编辑技术之后，CRISPR技术具有操作简便，效率高，特异性强，应用广泛等优势被称之为新一代（或第三代）基因编辑技术。至年CRISPR技术成功应用于真核生物细胞基因修饰以来，该基因编辑技术已成功应用于酵母，果蝇，线虫，斑马鱼，小鼠，大鼠，猪，猴，以及各种哺乳类动物和人的细胞系等基因的修饰。
上世纪70年代，首次应用外源DNA直接导入小鼠生殖细胞而建立的转基因（Transgenic）技术，开创了遗传修饰模式动物研制的基础，为基因功能（gainoffunction）研究提供了有效工具。随着80年代体外培养小鼠胚胎干细胞（ES）的成功，以及DNA同源重组技术的完善，ES基因打靶技术（genetargeting）的创立与发展，使构建各类复杂遗传修饰小鼠模型成为可能。ES基因打靶技术也成为过去30多年遗传修饰模式动物研制的主要方法，为基因功能研究，疾病模型建立，以及防治药物研制与评估提供了理想的工具。
然而，转基因技术的随机插入，ES打靶技术的小鼠ES体外培养等某些局限性，一定程度上限制了此类基因修饰技术的广泛应用。CRISPR基因编辑技术的出现则是对现有基因修饰技术的补充与改进。
CRISPR基因编辑技术绕过了ES打靶技术的细胞体外同源重组过程，直接通过原核注射的方法，在生殖细胞内对特定基因进行修饰而获得遗传修饰的模式动物。因此，CRISPR技术几乎可应用任何哺乳类动物基因修饰模式动物的研制。目前，除了大量关于CRISPR技术构建基因敲除小鼠与大鼠模型的报道外，也有各种基因定点敲入小鼠模型，条件性基因敲除小鼠模型，以及小鼠疾病模型等成功报道。如美国MIT张峰研究组应用传统ES打靶技术，首次构建了对Cas9基因表达可实施组织特异性调控的小鼠模型（条件性Cas9小鼠），在此基础上，他们应用CRISPR技术设计肺癌相关基因（如Kras，p53和Lkb1）的引导RNA,通过AAV9病毒载体，将相应的引导RNA导入条件性Cas9小鼠的肺部，成功建立了小鼠特异性肺癌模型。当然，在此条件性Cas9小鼠模型上，也可通过设计特定基因的引导RNA，构建针对不同基因的组织特异性敲除小鼠模型。
另外，应用CRISR技术也成功对猪，猴等大动物基因进行改造修饰，而这是传统基因修饰技术难以实现的。由于CRISPR基因编辑技术中针对靶基因的引导RNA非常小且构建方便，这为该技术用于多个基因的同时修饰提供了可能性。目前已有通过一次原核注射同时敲除三个基因的小鼠和猴模型的成功例子。
在开始应用CRISPR基因编辑技术构建基因敲除动物模型时，通常原则是通过设计能导致靶基因DNA序列移码突变的策略。为了真正确保基因敲除的保险效果，目前推荐的策略则是参照传统ES打靶技术的设计理念，在计划敲除DNA片段的两端设计各自的引导RNA，以达到敲除靶基因的DNA片段，从而获得靶基因功能完全敲除的模式动物。
应用于基因治疗方面的前景
传统基因治疗（genetherapy）技术通常是通过导入正常基因的方式来治疗基因缺陷相关的相关遗传性疾病，而新一代基因编辑技术CRISPR的出现，使其在基因治疗方面的优势更加显而易见的。该技术不仅可以对任何真核生物细胞基因进行敲除，而且可以对特定基因进行替换和改造，避免了转入基因随机插入基因组，造成癌基因激活等潜在风险。因此，CRISPR技术有可能成为现代基因治疗技术广泛应用于人遗传性疾病等防治的更优选择。
应用CRISPR基因编辑技术敲除与疾病发生发展相关的基因达到防治疾病的目的。如HIV病毒是通过感染人细胞上的相关靶点CCR5蛋白而引起AIDS，应用CRISPR技术敲除人血液细胞上靶点CCR5基因，阻碍了HIV入侵人体细胞，达到防治人感染HIV病毒的效果。而对于那些因基因突变缺失，造成蛋白功能损失的疾病，通过CRISPR技术在相关基因水平上进行改造修复，实现基因功能恢复的治疗作用，这是传统基因治疗技术难以实现的。
由于CRISPR基因编辑技术的巨大应用前景与可能的商业利益，目前国外以该技术为基础获得巨额风险投资的生物公司主要有EditasMedicine,CRISPRTherapeutics，IntelliaTherapeutics等，主要计划开展相关人遗传病如视网膜退行性疾病，遗传性肌肉疾病，以及血液疾病等防治领域的探索性研究。其中利用CRISPR技术治疗人遗传性视网膜退化疾病（LCA），有可能成为最早临床应用的疾病。该遗传性疾病因视网膜相关基因的突变可导致眼睛失眠。在小鼠模型研究中，研究者应用CRISPR技术，改造修复小鼠的相关突变基因，可成功改善小鼠视力。EditasMedicine拟在将该基因治疗技术应用临床试验中，这也将是首个CRISPR技术应用于临床研究项目。
肌肉营养不良症（DMD）是一种X染色体连锁的隐形致命性的遗传性疾病，其特征为患病男孩因某种抗肌肉萎缩的基因（Dystrophin）发生异常突变，造成男孩全身肌肉发育障碍，最终因呼吸与心脏衰竭而多死于20岁左右。目前临床前的小鼠模型试验已经证明，用腺相关病毒（AAV）作为载体，将CRISPR技术相应的引导RNA/Cas9转导入小鼠成年肌肉或血液细胞，敲除细胞内该致病基因的异常部分，使基因的保留部分恢复其正常功能，实现对DMD的基因治疗效果。这无疑为DMD基因疗法今后真正应用临床治疗提供了希望。
通过CRISPR技术对猪体内引起免疫排斥反应的相关基因以及内源性病毒DNA实施敲除，构建可供器官移植的遗传修饰的猪模型，在临床上将会有非常重要的应用价值。国内南京医科大学的戴一教授通过对器官移植排斥相关的三个猪基因进行敲除，构建了CRISPR敲除猪，为今后开展猪器官移植临床试验奠定了基础。
目前对于应用CRISPR技术进行人生殖细胞相关基因修饰与改造仍然存在着技术与伦理等方面限制。因此，研究者们则采取将CRISPR技术与人诱导多能干细胞（iPSC）相结合，在体外对相应基因进行修饰，再将改造过的iPSC应用到人相关疾病治疗作为可能的选择方案。
CAR-T细胞（Chimericantigenreceptor-T）作为免疫细胞疗法治疗肿瘤是当前肿瘤免疫疗法热点研究领域之一。年初有研究报道，利用CRISPR技术，借助AAV6病毒载体，成功构建小鼠TRAC基因敲除并具有抑制肿瘤细胞生长的CAR-T细胞，用该基因特定敲除的CAR-T细胞治疗肿瘤细胞移植小鼠，可显著延长修饰小鼠存活时间。
PD1（Programmeddeath1）作为一种免疫抑制分子，已成为重要肿瘤治疗的有效靶分子，针对PD1的人源化抗体已获得FDA批准进入临床治疗肺癌病人。直接利用CRISPR技术敲除PD1基因，验证其在临床试验中治疗人肺癌效果也是目前人们非常白癜风康复标准北京哪家医院白殿风
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