第五章辅助检查
第一节实验室检查
一、血常规及C反应蛋白
多数病例白细胞计数正常，病情危重者白细胞计数、C反应蛋白（CRP）及中性粒细胞比例可升高。并发脑炎，中性粒细胞比例可升高。
二、血生化检查
部分病例丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）轻度升高，病情危重者肌钙蛋白、血糖、乳酸升高。
三、脑脊液检查
神经系统受累时脑脊液符合病毒性脑膜炎和（或）脑炎的改变，可表现为：外观清亮，压力增高，白细胞计数增多，早期以多核细胞升高为主，蛋白正常或轻度增多，糖和氯化物正常。细菌学检测及培养阴性。
（一）轻症病例脑脊液检查：外观清亮，压力增高，白细胞增多，蛋白正常或轻度增多，糖和氯化物正常。
（二）重症病例脑脊液异常，压力增高，白细胞计数异常，潘氏实验可出现弱阳性或阳性。脑脊液检查常见的异常指标有：
1．肿瘤坏死因子-α肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是一种主要由单核巨噬细胞分泌的炎性因子，主要通过直接启动免疫性炎症反应或通过刺激其他炎症因子的大量释放间接启动免疫炎症反应过程，在炎症因子中处于“核心”地位。研究发现，TNF-α与手足口病炎症反应密切相关，合并脑炎的手足口病患儿血清和脑脊液中TNF-α水平显著升高，并且与患儿的病情呈正相关。因此，血清和脑脊液TNF-α的检测对手足口病合并脑炎的诊断有一定临床意义。
2．可溶性血管细胞间黏附分子可溶性血管细胞间黏附分子（sVCAM-1）是介导炎症细胞黏附、迁移的重要因子。病毒性脑炎时，由于病毒侵入机体和脑组织，激活T淋巴细胞，在活化的细胞和炎症因子的刺激诱导下，sVCAM-1释放增加，从而导致血sVCAM-1增高。研究发现，重症手足口病患儿脑脊液和血清sVCAM-1显著增高，且增高水平与手足口病病情危重程度明显相关，提示脑脊液和血清sVCAM-1水平变化可作为评估手足口病患儿神经损伤和病情严重程度的指标之一。
3．神经肽Y神经肽Y（NPY）属胰多肽家族成员，广泛存在于哺乳动物中枢和外周神经系统，是体内含量最丰富的神经肽之一。近年来，在脑炎、缺血缺氧性脑病、脑出血、癫痫等脑损伤疾病研究中均发现NPY水平增高。病毒性脑炎急性期机体处于应激状态，交感神经-儿茶酚胺系统异常激活，同时，病毒感染侵犯中枢神经系统，直接或间接激活机体免疫反应，多种生物活性分子释放，从而导致NPY水平增高。研究显示，手足口病重症患儿脑脊液和血清中NPY显著增高，且与病情的严重程度呈正相关，提示NPY对判断手足口病病情有重要的临床价值。
四、血气分析
呼吸系统受累时或重症病例可有动脉血氧分压降低、血氧饱和度下降、二氧化碳分压升高、酸中毒等。
五、病原学及血清学检查
（一）病原学检查
临床样本（咽拭子、粪便或肛拭子、血液等标本）肠道病毒特异性核酸阳性或分离到肠道病毒。急性期血清学标本检测相关病毒的IgM抗体阳性。
1．病原学检测的主要方法
（1）病毒分离：粪便标本是最常采集的标本，其他包括咽拭子或咽喉洗液、脑脊液、疱疹液或血清以及脑、肺、脾、淋巴结等组织标本。病毒分离培养对流行病学分析具有重要意义，但分离耗时（4～5天）。病毒分离培养对技术要求较高，费用较贵，时间长，不适用于流行期间同时处理大量样本。
（2）血清学病原检测：主要包括酶联免疫吸附测定（ELISA）、中和抗体试验、补体结合试验（CFT）。手足口病暴发流行时血清学检测不易区分EV-A71和CV-A16，只能通过核苷酸序列测定进行区分。ELISA法：主要用于检测病毒免疫球蛋白M（IgM）和免疫球蛋白G（IgG）抗体。特点是快速、经济、对实验室要求不高。检测人双份血清标本的中和抗体滴度时通常需用急性期血清与恢复期血清滴度进行比较，抗体滴度≥4倍增高证明病毒感染。因病毒感染后出现抗体需要一定时间，故ELISA法的早期诊断灵敏度不高。生物素-亲和素酶联免疫（BA-ELISA）法以抗EV-A71抗体为包被抗体，灵敏度、特异性、准确性及精密性均较高。中和试验：指将健康人或患者血清与标准肠道病毒株或患者自身分离的病毒株中和，测定机体的抗体水平。病毒感染后中和抗体在机体内存在时间较长，故该法是鉴定病毒的可靠方法，一定程度上还可反映机体的免疫力。如果中和实验中出现凝集，样本中有多个病毒会出现抗原漂移，影响抗原分型；接触病毒机会较多者亦容易出现抗体滴度的异常增高而混淆诊断。补体结合试验：补体结合抗体出现在感染早期，可鉴别近期感染或既往感染，由于血清与不同的EV型存在交叉反应，导致假阳性的结果相对较高。
（3）聚合酶链反应（PCR）：该技术几乎可检出病毒所有的血清型，与传统方法相比敏感性、特异性和检出率均较高。①反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）：检测时需将RNA反转录为cDNA，再进行特异DNA序列的扩增和检测。该技术克服了病毒分离培养和血清学方法相对繁杂费时，且在病毒流行期间无法满足同时处理大量样本的缺点，是肠道病毒感染的快速诊断手段。但其检测周期长，操作较复杂，结果判定过程复杂，反应产物污染率高。②实时荧光PCR：与常规PCR相比特异性强、自动化程度高、污染率低，目前为手足口病的首选检查方法。③内标多重荧光RT-PCR：该法结果可靠，能同时检测EV-A71和CV-A16且检出率明显高于传统方法。数据统计显示，该法存在假阴性现象，提示有传统PCR抑制物的存在。
（4）基因芯片技术：该技术是将DNA片段高密度地固化到经特殊处理的载体表面，在特定条件下与荧光标记的样品分子进行杂交，然后通过显微或扫描技术收集杂交信号，并利用生物信息学软件对杂交结果进行分析，从而获得样品的遗传信息，主要优点是可以同时检测多段基因，灵敏度较高；应用多组探针联合判断检测结果可有效降低假阳性率。此外，因基因芯片本身具备高通量、大规模的特点，用于鉴别诊断最有优势，可将多种病原体点样到芯片上进行联合诊断，从而确诊及排除疑似患者。
2．常见病原学检测标本和采集特点
（1）粪便标本或肛拭子标本：从国内外资料来看，粪便标本是目前EV病原学检测最为常用的标本。若采集不到患者粪便，也可以采集肛拭子标本。
（2）咽拭子标本：理论上是最早能够采集到病毒的标本。咽部是手足口病相关病毒最早感染繁殖的部位，采集简便易行。咽拭子要注意采集的部位、力度及采集时间。
（3）疱疹液作为病毒学检测标本同样有效，而且具有采样部位相对无菌的优点，只是采集起来相对困难，只有约一半的患者出现疱疹。有研究者针对不同标本的病毒学检测结果差异性做过相关研究，结果显示咽拭子标本和疱疹液标本差别不大，均可作为手足口病实验室诊断的理想标本。
（4）重症病例脑脊液EV-A71阳性检查，临床研究者针对重症病例的脑脊液除进行常规的RT-PCR检测外，还采用敏感度更高的实时荧光RT-PCR同时进行检测，结果检出EV-A71阳性结果的患者是唯一有较严重后遗症的患者。这也提示脑脊液EV-A71检测可能对于重症病例有重要意义。
3．近五年病原学检测相关的研究进展（1）血清病原蛋白质组研究新探索：由于血清中含有丰富的蛋白质成分，在不同的阶段有丰富的变化。从血清中发现分子标记可能对手足口病的早期诊断很有价值。蛋白质组学分析目前被认为是全球蛋白质表达评估的有力工具，已被广泛应用于研究疾病的生物标记。有研究者使用区别与传统的二维电泳技术的荧光差异双向电泳（TwoDimensionDifferenceGelElectrophoresi，2D-DIGE）和矩阵辅助的激光照射/电离时间/质谱（Matrix-AssistedLaserDesorption/IonizationTimeofFlightMassSpectrometry，MALDI-TOF-MS）方法，通过该技术的高灵敏度和可重复性，用一种全新的方式来探索手足口病疾病蛋白质组研究。寻找用于手足口病早期诊断的潜在的生物标记物蛋白。该技术构造的识别手足口病蛋白质相互作用网络。
（2）柯萨奇病毒快速检测方法的进展：近年有研究人员开发了一种逆转录环介导等温扩增（ReverseTranscriptionLoop-MediatedIsothermalAmplification，RT-LAMP）与侧流设备（Lateral-FlowDevice，LFD）技术相结合的技术，以快速检测CV-A16病毒。该技术使用RT-LAMP分析方法对CV-A16的VP1基因进行了优化。采用LFD和毛细管电泳对放大产物进行了分析。研究分析表明，该方法在检测CV-A16时表现出%的特异性，检测灵敏度为0.55半数组织培养感染量（TissueCultureInfectiveDose，TCID50）/反应体系。将RT-LAMP-LFD试验与之前在临床试验中使用的实时RT-PCR方法进行比较，结果显示93%的结果一致性。但与传统RT-PCR方法比较，RT-LAMP-LFD分析在检测CV-A16RNA时更加灵敏。这种技术的高灵敏度和特异性以及它的易用性，使这种分析技术在发展中国家的初级保健设施和临床实验室等资源有限的环境中是很理想的选择。
（3）快速甄别总肠道病毒的基因分型方法的探索：肠道病毒鉴定的金标准是病毒分离和培养，随后用中和实验确定血清型。这一传统的诊断方法有其缺点：①耗时、费力，时间长；②64种血清型抗体库中只有40种抗体，有时存在交叉反应；③全球范围30年前制备的抗血清有限；④毒株或抗原变异导致抗体凝集；⑤有些肠道病毒在细胞中复制能力较差难以分型；⑥当需要更深入地了解更多详细的病毒特征时，需要同时接种多种细胞株进行病毒分离培养，找出敏感的细胞株，耗时费力，工作量非常大。有研究人员建立在总肠道病毒的保守区设计引物扩增，确保单管单反应能扩增出所有肠道病毒血清型的检测方法，该方法通过特异地扩增总肠道病毒，以不同病毒滴度的EV-A71验证方法的灵敏度，1×拷贝数/μL的标本能成功扩增，方法学上达到了目前PCR方法的灵敏度标准。该方法在获取临床标本后，1小时内完成RNA提取，RT-PCR扩增2小时内完成，测序也在3小时内完成，所以一旦有手足口病疫情，不管是哪一种肠道病毒引起，一天之内就可以出具分析报告，指导临床治疗和卫生决策。具有快速、方便、准确、高效的特点。
（4）多病毒检测平台的建立：一种能同时、快速、准确地检测包括：麻疹病毒、风疹病毒、肠道病毒71型、水痘带状疱疹病毒、登革热病毒、人类小DNA病毒B19、柯萨奇病毒A16型、A组P型酿脓链球菌（溶血性链球菌）、伤寒沙门菌，9种发热伴出疹病原体的化学发光基因芯片的平台已经在国内建立。该平台建设属国家科技重大专项传染病应急处置检测技术平台资助项目。该平台基于基因芯片技术建立的化学基因芯片具有良好的检测特异性和灵敏度，用于发热伴出疹疾病的检测，提供了一种新的临床诊断手段。多重PCR与基因技术的整合，实现两种技术的优势互补，多重PCR和基因芯片技术的优势相综合，使用多重PCR和基因芯片联用的技术可以高效特异的检测多重发热伴出疹病原。在芯片采集与分析方法中采用推广成本很低的便携式化学发光芯片成像仪采集信号，降低芯片成本，提高灵敏度，且整个过程仅需1.5小时，提高了效率。但基于临床样本来源的限制，该方法的准确度和灵敏度仍需接受大样本临床检测的进一步验证。
（二）血清学检查急性期与恢复期血清CV-A16、EV-A71或其他可引起手足口病的肠道病毒中和抗体有4倍及以上升高。
1．部分轻症病例可有轻度ALT、AST、CK-MB升高。
2．重症病例除了外周血白细胞异常，血糖升高也与重症病例存在的合并神经系统损害密切相关。有研究认为白细胞增加及血糖升高是自主神经系统功能失调的表现之一。研究发现，有部分手足口病患儿在尚未出现神经系统表现前血糖已明显升高，应引起高度警惕。患儿一旦出现高血糖及肢体无力常提示病变累及脑干。因此，动态监测血糖变化对早期发现重症病例有重要意义。
3．血清学神经损伤的相关指标变化特征研究显示血清S钙结合蛋白B（SB）和神经元特异性烯醇化酶（NSE）水平变化与重症患儿病情发展密切相关，SB和NSE作为一对组合指标用于反映脑损伤和神经系统功能状况在临床上引起了白癜风治疗周期小孩得白癜风怎么办
联系电话：